百螢Annexin V-mFluor Violet 540標記實驗方案

一、百螢annexin v-mfluorviolet 540標記概述
百螢annexin v-mfluorviolet 540標記探針用于檢測細胞功能的探針膜聯蛋白是在鈣存在下與磷脂膜結合的蛋白質家族。annexin v 是研究細胞凋亡的重要工具。它用作檢測在細胞表面表達磷脂酰絲酸的細胞的探針，這是在細胞凋亡和其他形式的細胞死亡中發現的特征。有多種參數可用于監測細胞活力。annexin v 染料偶聯物廣泛用于通過測量磷脂酰絲酸 (ps) 的易位來監測細胞凋亡。在細胞凋亡中，ps 被轉移到質膜的外層。細胞表面磷脂酰絲酸的出現是細胞凋亡初期/中期的普遍指標，可以在觀察到形態學變化之前檢測到。這種熒光膜聯蛋白 v 結合物具有類似于 pacific orange?（pacific orange? 是 invitrogen 的商標）的光譜特性。橙色熒光染色在 405 nm 的紫色激光下很好地激發，并在 ~560 nm 發出強烈的藍色熒光。
二、百螢annexin v-mfluorviolet 540實驗方案
分析方案
概述
用測試化合物（200μl/樣品）制備細胞
添加annexin v結合物測定溶液
室溫孵育30-60分鐘
用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析
1.用膜聯蛋白v綴合物制備和孵育細胞：
1.1制備膜聯蛋白v結合測定緩沖液：10mm hepes，140mm l和2.5mm cacl2，ph 7.4。
1.2用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的jurkat細胞4-6小時）以誘導細胞凋亡。
1.3離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。
1.4將細胞重懸于200μl膜聯蛋白v結合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。
1.5在細胞中加入2μl膜聯蛋白v結合物。
可選：在細胞內加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。
1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。
1.7在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μl膜聯蛋白v結合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。
1.8使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。
2.使用流式細胞儀分析：
通過使用具有適當過濾器的流式細胞儀來量化膜聯蛋白v綴合物。
注意：粘附細胞上的膜聯蛋白v結合流式細胞術分析未經常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發生特定的膜損傷。 然而，casiola-rosen等人先前報道了利用膜聯蛋白v對貼壁細胞類型進行流式細胞術的方法。 和van engelend等人（見參考文獻1和2）。
3.使用熒光顯微鏡分析：
3.1移取步驟1.6的細胞懸液，用膜聯蛋白v結合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯蛋白v結合測定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細胞。 將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。
注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。 與膜聯蛋白v綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯蛋白v結合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯蛋白v結合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉蓋玻片并觀察細胞。 在與膜聯蛋白v綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。
3.2在熒光顯微鏡下用適當的濾光片分析膜聯蛋白v綴合物的凋亡細胞
三、百螢annexin v-mfluorviolet 540標記光譜特性
吸光度（納米）
401
校正因子（260nm）
1.326
校正因子（280nm）
0.543
消光系數（cm-1m-1）
180001
激發（納米）
402
**（納米）
535
產率
0.211
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